ヒトアデニル酸キナーゼ(AK)は、MgATP2- + AMP2- MgADP- + ADP3- の反応を触媒し、細胞内アデニンヌクレオチドの動的平衡に関与していると考えられています。本酵素は、古くから多種の動物種によってその一次構造が解明され、X線回折や、NMR用いた研究において最良のモデル酵素として注目されていて、基質結合部位、触媒部位に関して諸検索が行われていますが、いまなお、その詳細は、分かっていません。また、本酵素の病態学的意義として、遺伝性疾患でもある筋ジストロフィー患者血清での異常アデニル酸キナーゼアイソザイムの蛋白質発現や、赤血球内の本酵素の一アミノ酸変異(Arg128Trpへのアミノ酸置換)による溶血性貧血などが、報告されています。本研究は、アデニル酸キナーゼという生体のエネルギー代謝に重要な役割を果たしているリン酸転移酵素に、遺伝子レベルで変化を起こさせる部位特異的変異法を用い、その構造と機能の相関について調べました。アデニル酸キナーゼの基質結合部位の同定や構造と機能の研究は、リン酸転移反応機構やヌクレオチド結合蛋白質の基質認識機構の研究に極めて重要であり、解明が期待される所であります。リン酸転移酵素の基質結合に関して、ヒトアデニル酸キナーゼを使用して、アミノ酸残基の機能を調べることと、基質とのアミノ酸残基との相互作用を調べる目的で、蛋白質工学的に、アミノ酸を部位特異的に変異させ、構造と機能を調べました。ヒトアデニル酸キナーゼ酵素の人工遺伝子を使用し、哺乳動物種間で相同性の高いリジン残基、C末端領域の疎水性アミノ酸のロイシン残基とバリン残基に着目し、ランダムに置換し、得られた変異型酵素と野生型酵素を反応速度論的に比較解析を行い、本酵素と基質(ATPAMP)との相互作用を調べました。

本研究成果の要点は、1)ヒト骨格筋アデニル酸キナーゼの人工合成遺伝子を用い、site-directed mutagenesisという手法を一部工夫し、標的部位のアミノ酸残基にランダムに変異を導入することに成功し、容易に蛋白質発現する手法を開発した点、2)動物種間で相同性の高いリジン残基(Lys9, Lys21, Lys27, Lys31, Lys63, Lys131, Lys194)に対しランダムにsite-directed mutagenesisを行い、26種類の変換体アデニル酸キナーゼを得ました。数多くのアミノ酸残基の中で、リジンが塩基性であり、基質のリン酸基と相互作用をしている可能性が高かったことにより、リジンのアミノ酸残基の変換体を人工合成しました。3)野生型酵素と得られた変異型の大腸菌での蛋白質発現を行い、精製し、定常状態でのキネティックスを調べ、その性質の変化を野生型と比較しました。リジン残基の変換体は、様々な程度に基質とのアフィニティーを減少させるものや、リン酸転移触媒効率を減少ないし、増加させるものなどを示したことから、調べ得た範囲内で、親水性塩基性リジン残基は酵素活性に必須なアミノ酸残基であることが示唆され、NMR究やX線回折研究によります立体構造モデルに、動的な生理学的な立体構造モデルを提唱する試みを行いました。

研究の成果は、Takanori Ayabe, et al., Biochemistry 36, 4027-4033 (1997),” Essential Lysine Residues in the N-terminal and the C-terminal Domain of Human Adenylate Kinase Interact with Adenine Nucleotides as found by Site-Directed Random Mutagenesis.”に、Ayabe, et al., Journal of Biochemistry 128, 181-187, 2000."Hydrophobic alterations in the C-terminal Domain of Human Adenylate Kinase and the Binding of Adenine Nucleotide Substrates."に報告し、さらに、その研究成果が世界的に認められ、2002年度に発刊されたワイリー分子医学百科事典"Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, 5 Vol. Set, 2002"Adenylate Kinaseの項目の分担執筆論文の参加へと、発展させることができました("Adenylate Kinase", Takanori Ayabe et. al., Edited by Thomas Creighton, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, pp76-77, 2002, Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine.)。いまや優れた百科事典として定評を確立している「ワイリー分子生物学百科事典全4巻セット」を継承したその姉妹編でもある「ワイリー分子医学百科事典全5巻セット」は、いまやヒト分子生物学の全体像をカバーするはじめての百科事典であり、医学と分子生物学のあらゆる面をカバーする1300項目を含んだ、統合した決定的かつ権威あるリファレンスである。この分野のレファレンスの規範となるものに貢献できたことは、まさしく光栄と思わます。