綾 部 貴 典

 

 

 

 

 

 

Lysine Residues in Human Adenylate Kinase are Essential for Interaction with Adenine Nucleotides as Found By Site-Directed Random Mutagenesis  (投稿中)

 

Takanori Ayabe, Hitoshi Takenaka, Osamu Takenaka, Michihiro Sumida, Seung Kyu Park, Toshio Onitsuka, Koichiro Shibata, Seiichi Uesugi, and Minoru Hamada

 

 

 

 

 

【背景、目的】ヒトアデニル酸キナーゼ(AK)は、MgATP2- + AMP2- MgADP- + ADP3- の反応を触媒し、細胞内アデニンヌクレオチドの動的平衡に関与していると考えられている。臨床的には、本酵素の遺伝的異常症や変異酵素(Arg128のTrpへのアミノ酸置換)による溶血性貧血などが、報告されている。他の動物種における本酵素の立体構造モデルが、X線回折、NMR 解析などの結果から提唱されているが、ヒト本酵素において、基質結合部位や触媒に関与する必要最少残基は、未だに、特定されていない。基質と酵素の相互作用を解明するために、必須と思われる保存性の高いリジン残基を選択し、部位特異的変異導入により、これらのアミノ酸残基を他のアミノ酸にランダムに置換した変異体を多数作製し、野生型AKと変異体の酵素活性を調べ、AKの触媒部位と基質結合部位の特定をする目的で本研究を行った。

【方法】 (1)ヒトAK遺伝子を人工合成したcDNA(pAK、Kim et al., 1990)をpMEX8-hAK1へとベクター改築を行った。(2)動物種間で相同性の高いリジン残基(Lys9, Lys21, Lys27, Lys31, Lys63, Lys131, Lys194)を選び、それらに対するXXY codon (X; A, G, C, or T, Y; G ro C)で構成されるannealing primerを用い、site-directed mutagenesisを行った。(3)DNA cycle sequenceにより変異導入プラスミドをスクリーニングし、野生型と変異型の大腸菌での培養、蛋白質発現を行った。(4)Blue sepharose column chromatography、及び、Superose 12 gel filtrationにより、野生型、変異型を分離精製し、比活性測定、さらに、定常状態でのキネティックスを調べた。

【結果】(1) 7つのリジン残基に対して、22種類の変異体を得た。 遺伝子変異は、Lys9 → Pro, Phe, Leu, Thrへ、Lys21 → Proへ、Lys27 → Arg, Leu, Ile,Valへ、Lys31 →Phe, Ile, Serへ、 Lys63 → Pheへ、Lys131 → Ala,Phe,Proへ、Lys194 → Ser, Ile, Leu, Pro, Asn, Valへの置換であった。(2)変異酵素の蛋白質発現量、及び、比活性値は、野生型と比較して、著明な低下が見られた。(3) (a)Lys9残基は、ATP, AMP両基質に関与すると思われた。(b)Lys21は、ATPとAMPの両基質結合に関与するが、より強くATPに関与することが観察された。(c)Lys27とLys131は、ATPに強く関与し触媒の役割の一部に寄与していることが示唆された。(d)Lys63はATPとの相互作用に強く関与するものと思われた。(e)C末端Lys194は、 ATPだけでなく、AMPとの相互作用にも関与することが示唆された。

【まとめ】(1)ヒトAKをコードするcDNAを用い、random site-directed mutagensisを行い、比較的容易に短時間に複数のmutantを一度に得る大腸菌発現系を確立した。(2)変異型酵素のキネティックス解析の結果、アデニンヌクレオチド基質とのアフィニティーを減少させるものや、リン酸転移触媒効率を減少させるものなど、多様であった。(3)ヒトAKにおいて、リジン残基の他のアミノ酸残基への置換は、基質親和性や触媒作用に影響を与えたことから、調べ得た範囲での親水性塩基性リジン残基は酵素活性に必須なアミノ酸残基であることが示唆され、X線回折モデルに挿入することにより、本酵素活性部位における2つの基質との相互作用を推察する試みを行った。

 

【参考論文】

1. Takanori Ayabe, Hitoshi Takenaka, Osamu Takenaka, Akiko Takenaka, Hiroyuki Nagahama, Hideharu Maruyama, Atsushi Yamamoto, Masahiko Nagata, Yasunori Koga, Michihiro Sumida, and Minoru Hamada, Construction of the Plasmid pMEX8-hAK1 and random Site-direct Mutagenesis of human cytosolic adenylate kinase”, 1996, Biochem. Mol. Biol. Int. 38, pp. 373-381.

2. Takanori Ayabe, Hitoshi Takenaka, Toshio Onitsuka, Koichiro Shibata, Osamu Takenaka, Seiichi Uesugi, and Minoru Hamada, “Steady-state Kinetics of Thr35- and Thr39-mutants in Human Adenylate Kinase by Site-Directed Mutagenesis”, Protein and Enzyme (in press).

3. Takanori Ayabe, S. K. Park, H. Takenaka, M. Sumida, S. Uesugi, O.Takenaka, and M. Hamada, “Catalytic roles of Lysines (K9, K27, K31) in the N-terminal domain in human adenylate kinase by random site-directed mutagenesis”, Biochemistry and Molecular Biology International (in press).